蛋白纯化

样品在纯化前建议离心或用 0.22 μm 或 0.45 μm 滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率。 1. 磁珠预处理 1) 充分混匀琼脂糖磁珠，依照所需纯化的样品量，取适量 Anti-HA 琼脂糖磁珠混悬液加入离心管中，置于磁性分离器上，磁性分离 1 min，弃上清。 2) 加入与悬浮液体积相同的的平衡缓冲液，用移液器反复吹打 5 次以上使其充分混匀，磁性分离 1 min，弃上清，重复 2-3 次。 2. 样品结合 加入样品，封闭离心管，置于混匀仪上 4°C 孵育 1-2 h 或室温孵育 0.5-1 h（具体孵育时间可根据结合效果调整）。 5 6 3. 洗涤 孵育完成后，磁性分离 1 min，取出上清（上清可保留作为流穿液，用于电泳鉴定）。使用 5 倍磁珠体积的洗涤缓冲液清洗，磁性分离 1 min，弃上 清，重复 3-5 次。 注：最后一次洗涤更换新离心管。 4. 提供两种洗脱方案，可根据需要选择不同的洗脱方案。 1) 酸性洗脱：此方法洗脱的样品保持原有生物活性，可用于后期功能分析。 使用 3-5 倍磁珠体积的洗脱缓冲液Ⅰ进行洗脱，用移液器反复吹打 5 次以上使其充分混匀，置于混匀仪上室温孵育 5-10 min，磁性分离 1 min，收 集上清液并立即用中和液缓冲液中和 pH （总洗脱液体积的 1/10），样品可用于后期功能分析。可重复 2-3 次并分别收集上清液。 注：a. 酸性洗脱后磁珠要立即用结合缓冲液平衡，Anti-HA 琼脂糖磁珠在洗脱液中不要超过 20 min。 b. 洗脱后蛋白短期可 4℃ 存放，若要长期存放建议置于 -20℃ 中。 2) 竞争性洗脱：此方法洗脱的样品保持原有生物活性，可用于后期功能分析。 使用 3-5 倍磁珠体积的洗脱缓冲液Ⅱ进行洗脱，用移液器反复吹打 5 次以上使其充分混匀，置于混匀仪上 4℃ 孵育 30 min，磁性分离 1 min，收集 上清液即为目标蛋白。 注：洗脱后蛋白短期可 4℃ 存放，若要长期存放建议置于 -20℃ 中。

免疫沉淀/免疫共沉淀

1. 磁珠预处理 1) 取适量 Anti- HA 琼脂糖磁珠混悬液加入离心管中，置于磁性分离器上，磁性分离 1 min，弃上清。 2) 加入与悬浮液体积相同的的平衡缓冲，用移液器反复吹打 5 次以上使其充分混匀，磁性分离 1 min，弃上清，重复 2-3 次。 2. 样品结合 将含有 HA 标签的靶蛋白样品加入到磁珠中，置于混匀仪上 4°C 孵育 1-2 h 或室温孵育 0.5-1 h（具体孵育时间可根据结合效果调整）。 3. 洗涤 孵育完成后，磁性分离 1 min，取出上清（上清可保留作为流穿液，用于电泳鉴定）。使用 5 倍悬浮液体积的洗涤缓冲液清洗，磁性分离 1 min，弃上 清，重复 2-3 次。得到靶蛋白-磁珠复合物。如进行免疫沉淀实验，则直接跳转第 6 步进行洗脱。如进行免疫共沉淀实验，则需第 4、5 步进行共沉 淀。 4. 共沉淀 将含有目标蛋白的样品加入到靶蛋白-磁珠复合物中，置于混匀仪上 4°C 孵育 1-2 h 或室温孵育 0.5-1 h（具体孵育时间可根据结合效果调整）。 5. 洗涤 孵育完成后，磁性分离 1 min，取出上清（上清可保留，用于电泳鉴定）。使用 5 倍悬浮液体积的洗涤缓冲液清洗，磁性分离 1 min，弃上清，重复 2-3 次。得到目标蛋白-靶蛋白-磁珠复合物。 6. 洗脱 提供三种洗脱方案，可根据需要选择不同的洗脱方案。 1) 酸性洗脱：此方法洗脱的样品保持原有生物活性，可用于后期功能分析。 使用 3-5 倍磁珠体积的洗脱缓冲液Ⅰ进行洗脱，用移液器反复吹打 5 次以上使其充分混匀，置于混匀仪上室温孵育 5-10 min，磁性分离 1 min，收 集上清液并立即用中和液缓冲液中和 pH （总洗脱液体积的 1/10），样品可用于后期功能分析。可重复 2-3 次并分别收集上清液。 注：a. 酸性洗脱后磁珠要立即用结合缓冲液平衡，Anti-HA 琼脂糖磁珠在洗脱液中不要超过 20 min。 b. 洗脱后蛋白短期可 4℃ 存放，若要长期存放建议置于 -20℃ 中。 2) 竞争性洗脱：此方法洗脱的样品保持原有生物活性，可用于后期功能分析。 使用 3-5 倍磁珠体积的洗脱缓冲液Ⅱ进行洗脱，用移液器反复吹打 5 次以上使其充分混匀，置于混匀仪上 4℃ 孵育 30 min，磁性分离 1 min，收集 上清液即为目标蛋白。 注：洗脱后蛋白短期可 4℃ 存放，若要长期存放建议置于 -20℃ 中。 3) 变性洗脱：此方法洗脱的样品适用于 SDS-PAGE 检测。 在上述洗涤干净的磁珠中加入等体积的 2× SDS-PAGE Loading Buffer，充分混匀后 95℃ 加热 5 min。磁性分离 1 min，收集上清液进行 SDS-PAGE 检测。 注：由于常规 SDS-PAGE Loading Buffer 中含有 β-疏基乙醇和 DTT 会使填料中抗体轻重链断开，同时含有 SDS 的 Loading Buffer 可以使介质配体 变性，因此变性洗脱后的 Anti-HA 琼脂糖磁珠不能重复使用。 5 存储条件 4°C ，2 年 禁止冻结 5

注意事项

1. 请勿离心、干燥或冷冻磁珠。以上操作可能会引起磁珠聚团，并影响磁珠的结合活性。 2. 使用本产品进行 IP 实验前，需先确认样品中 HA 标签蛋白的表达情况。 6 3. 为最大限度的降低蛋白质降解，请配合使用 MCE 蛋白酶抑制剂 cocktails (MCE 货号 HY-K0010，HY-K0011)。 4. 不要使用含有 DTT 的细胞裂解液样品，DTT 可能会引起凝磁珠上的 HA 抗体脱落。 5. 本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。 6. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作