1. 抗原样品制备

根据不同的样品选择合适的处理方法

2. 磁珠预处理

混悬 Anti-Flag 磁珠，取 10 μL 磁珠，置于 1.5 mL EP 管中，加入 500 μL 洗涤缓冲液，充分混悬，置于磁力架上磁性分离，弃上清。重复以上洗涤步骤 2 次。

3. 样品的结合

在上述分离得到的磁珠中加入 500 μL 细胞裂解液，充分混悬，置于翻转混合仪孵育，室温孵育 2 小时或者 4℃ 条件下孵育过夜。置于磁力架上磁性分离，弃上清。

注： 结合过程中，磁珠可能会出现聚团或呈片状，属于正常现象，不会影响实验结果。

4. 洗涤

在上述分离得到的磁珠中加入 500 μL 洗涤缓冲液，充分混悬磁珠，磁性分离，弃上清。重复以上洗涤步骤 3 次，直到洗涤后的上清液中 OD₂₈₀ 小于0.05 为止。

注： 如上清液的 OD₂₈₀ 大于 0.05，适当增加洗涤次数即可。

5. 洗脱

本说明书提供三种 Flag 标签蛋白洗脱方案，操作者可以根据后期检测的需要选择不同的洗脱方案。

1) 变性洗脱法：此方法洗脱的样品适用于 SDS-PAGE 检测。 步骤：分离磁珠，弃上清，向磁珠中加入 50 μL 的 1× SDS-PAGE Loading Buffer 混合均匀，95°C 加热 5 分钟。分离磁珠，收集上清至新的 EP 管，进行 SDS-PAGE 检测。

2) 酸性洗脱法：此方法洗脱的样品保持原有生物活性，可用于后期功能分析。 步骤：分离磁珠，弃上清，向磁珠中加入 50 μL 的洗脱缓冲液 A (0.15 M Glycine, pH 2.5-3.1) 混合均匀，室温孵育 10 分钟。分离磁珠，收集上清至新的 EP 管，按每 50 μL 洗脱液加入 25 μL 中和缓冲液的比例加入中和缓冲液 (1 M Tris-HCl, pH 8.0)，将洗脱产物 pH 调节至中性，样品用于后期功能分析。

3) 竞争性洗脱法：此方法洗脱的样品保持原有生物活性，可用于后期功能分析。 步骤：分离磁珠，弃上清，向磁珠中加入 3-5 倍磁珠体积的洗脱缓冲液 B (1 mg/mL 3× Flag peptide, 50 mM Tris, 0.15 M NaCl, pH 7.4)混合均匀，室温孵育 1 小时或者 4°C 条件下孵育 1-2 小时。分离磁珠，收集上清至新的 EP 管，即为目的蛋白，样品用于后期功能分析。